科研 Environ Pollut：与环境相关杀菌剂的水平改变真菌群落的组成和相互作用但未改变其功能
科研 Environ. Pollut.：与环境相关杀菌剂的水平改变真菌群落的组成和相互作用，但未改变其功能
水生丝孢菌（AHs）是一种生活在沉水落叶中的腐生真菌，作为河流ECO中的分解者以及更高营养水平的食物来源发挥着关键的功能作用。
水生丝孢菌（AHs）是一种生活在沉水落叶中的腐生真菌，作为河流ECO中的分解者以及更高营养水平的食物来源发挥着关键的功能作用。杀菌剂控制着病原真菌和靶向真菌中进化保守的分子过程，在农业和城市景观的使用的过程中会污染河流。因此，杀菌剂对水生丝孢菌及其提供的功能构成了威胁。为了研究杀菌剂对水生丝孢菌群落组成和功能的影响，我们分别单一和混合培养了四种AH物种，设置了5个杀菌剂的浓度（0、5、50、500和2500 μg/L）。通过定量实时PCR分析了物种的生物量。此外，还研究了叶片的分解作用。在单一培养中，没有物种受到环境相关杀菌剂水平（5和50 μg/L）的影响。即使在高杀菌剂水平（≥500 μg/L）下，尽管效率较低，两种最耐受的物种也能够定殖和分解叶片。在混合培养中，叶片分解的变化反映了单一培养中最耐受物种的响应方式。因此，能够最终靠与功能冗余相结合的耐受物种来保护叶片分解过程。然而，在所有杀菌剂处理中，敏感物种被取代，真菌之间的相互作用从互补变为竞争。我们的数据表明，由于AH群落组成决定了消费者叶片的营养质量，杀菌剂暴露会在食物网中引起自下而上的影响，而不是对叶片分解的损害。
译名：与环境相关的杀菌剂水平会改变真菌群落的组成及相互作用，但未改变其功能
的叶片质量损失（分别为2.6%和-4.4%；图1a），因此无法检测到杀菌剂对其降解能力的潜在影响。相反，
功能仅在杀菌剂总浓度为2500 μg/L处理下产生了显著变化（图1a）。ANCOVA分析结果（表S2）表明，所有单一培养和混合培养中，叶片质量损失和累积酶活性之间有强烈的线性关系，这种关系没有被杀菌剂显著改变（表S2），通常可能会影响酶的底物亲和力。与早期的研究一致，所研究的AH物种的降解能力似乎基于不同的酶活性（图2a-d)。而
则不在所研究酶的范围内（图2b），这可能是由于在本实验中观察到该物种的生物量低，由于生产力较低（图1b）或不同的叶片定植策略不同。与叶片质量损失类似，杀菌剂仅在500和2500 μg/L的高浓度下影响酶活性（图2a-d），表明在环境相关的杀菌剂浓度下，所研究的酶没发生明显变化。
图1. 在0、5、50、500和2500 μg/L的杀菌剂总浓度（灰色柱状图）的真菌物种处理中，平均叶片质量损失（a）和麦角甾醇浓度（b；分别具有95%的置信区间）和基于生物量特定叶片质量损失或麦角甾醇浓度的平均预测（具有95%置信区间的红点）。水平实线和虚线分别表示无菌对照(a)的平均值和95%置信区间。黑色星号表示真菌物种处理中杀菌剂处理和无杀菌剂对照之间差异显著（Dunnett检验；
0.05；n=5）。红色星号表示观察变量和预测变量之间差异显著（配对t检验；
0.05；n=5）。每个物种的预测基于无杀菌剂单一培养中的生物量特定叶片质量损失和麦角甾醇浓度（因此，平均预测等于这些处理中的平均值；AA：
图2. 使用欧几里德距离的酶活性曲线的非度量多维标度（NMDS）。面板（a-l）中显示的数据来自距离矩阵。图中显示了0、5、50、500和2500 μg/L的杀菌剂总浓度的单一培养物和混合培养物的酶活性。处理和重复分别用正方形和圆形表示。红色箭头显示酶活性。提供的应力值表示合理的拟合（即0.2）。有关处理因素对酶活性谱的影响，请见表S3（AA :
, PHO:磷酸酶, AGL: α-1,4-葡萄糖苷酶, BGL: β-1,4-葡萄糖苷酶, CEL: 纤维二糖水解酶, XYL: β -1,4-木糖苷酶过氧化物酶、PER：过氧化物酶和PHE：酚氧化酶）。（为了解释图例中对颜色的引用，读者可以借鉴本文的网络版本。）
的真菌生物量（取决于麦角甾醇或DNA分析）维持在恒定水平，直至杀菌剂总浓度为50 μg/L。在较高的杀菌剂浓度下，无法检测到或检测到非常低的生物量（图1b；图3a和b）。同样，即使在最高杀菌剂总浓度下，
也具有可测量的麦角甾醇含量，而与对照相比显着降低（分别为-84%和-64%；图1b）。这种影响也反映在
的DNA浓度上（图3d)。相比之下，当杀菌剂总浓度为50和500 μg/L时，
的DNA水平明显地增加（高达65%），而麦角甾醇含量保持不变（图1b；图3c），导致过度预测基于DNA的麦角甾醇浓度（图1b）。这种模式很可能是由混合物中的一种杀菌剂（戊唑醇）对两种生物标志物产生的直接影响引发的。这种效应会导致生物标志物水平发生明显的变化，而不能反映真正的菌丝体生物量。尽管如此，
相比则更敏感。这种敏感性与之前的研究一致，通过形态学鉴定和量化称为分生孢子的无性孢子来评估AH物种的生产力。在这些研究中，有研究者认为，增加杀菌剂的浓度减少芽孢形成的
图3. 在总浓度为0、5、50、500和2500 μg/ L的杀菌剂的真菌物种处理中，
的平均DNA浓度（具有95%置信区间）（灰色柱状图）。星号表示杀菌剂处理和无杀菌剂对照之间差异显著（Dunnett检验；
常存在于被金属或异生物质严重污染的水生生态系统中，AH群落中占主导地位。因此，考虑到本研究中研究对象是真菌，这些物种对杀菌剂的显著耐受性可以假设是基于高度复杂的解毒系统。然而，AHs的解毒过程的研究主要是针对金属和谷胱甘肽含量的增加进行。谷胱甘肽合成的增加被认为在
的金属耐受性中起最大的作用。然而，这种解毒途径也可以解释这些物种对合成杀菌剂的耐受性，因为谷胱甘肽参与了在二阶段生物转化反应中形成的活性氧的消除，以及异种生物的结合。此外，真菌木质素分解酶（例如，过氧化物酶和酚氧化酶）可以代谢芳香异生物质，减轻它们的毒性。然而，作为本研究中最耐受的AH物种，其氧化酶活性没有升高(即
；图2d)，这一降解途径可能为非必须途径。为了解开潜在的生物转化过程，“-组学”（例如，基因组学、转录组学和蛋白质组学的应用）和化学分析（杀菌剂及其代谢物的内部浓度与外部浓度）的组合是一种有效的研究方法。
基于DNA浓度的叶片质量损失预测在很大程度上与杀菌剂的单一培养中的观察结果相符（图1a）。因此，杀菌剂可能不可能影响生物质特定的功能。然而，16次比较中种有3次结果存在非常明显差异（图1a）：两种情况可能是由于杀菌剂改变了DNA浓度（如上所述）高估了
叶片分解的结果（Baudy等，2020）。此外，在500 μg/L的杀菌剂总浓度下，
分解的叶片比预测的要多（图1）一种。由于这种效应与杀菌剂混合物浓度无关，无法用酶活性或其他变量来解释（图1b；图2d），因此该结果可能是偶然的。
无论杀菌剂浓度如何，二元培养基和四元培养基中的叶片质量损失、真菌生物量产生和酶活性曲线均表现出与在单一培养中最高产和耐受性物种中观察到的结果相似（图1；图2）。因此，正如假设的那样，在高杀菌剂浓度的混合培养物仍能维持其功能。对于这两个功能，与观察结果显著不同的预测主要包括
的混合AH培养物（70组对比中包含6组；图1)，上文已提及。同样，关于其他混合培养的少数显著差异可能不是杀菌剂影响的结果，因为这些反应不依赖于浓度，并且不能用其他变量来解释（图1b；图2）。因此，正如在单一培养中观察到的那样，杀菌剂不影响混合培养中的生物质特异性功能。
在二元培养基中，杀菌剂导致单个物种DNA浓度的响应模式与在单一培养中观察到的结果相似（图3）。然而，在四元培养基中，较低的杀菌剂总浓度（即5 μg/L）使
在培养中资源竞争加剧，进一步增加了敏感物种对杀菌剂的敏感性。虽然不能排除体细胞（菌丝）生长和（无性）繁殖之间的权衡（即增加分生孢子的产量以牺牲菌丝在叶片底物上的生长)，但之前已经有研究表明，杀菌剂整体上抑制了AHs中分生孢子的产量。尽管如此，四元培养基中
相比；图3)，本研究表明，在50 μg/L浓度下，杀菌剂对群落组成有显著影响。
在定殖过程中，群落组成的变化伴随着物种相互作用的变化。净多样性效应与群落遗传分化正相关（协同互作随遗传距离的增加而增加（图S1）；，而在二元培养基中基本不受影响（图4）。然而，在四元培养基中，净多样性效应（部分显著）从无杀菌剂对照中的3%降低至杀菌剂总浓度为5和50 μg/L时的-32%和-38%（图4g）。净多样性效应降低是由性状独立互补效应的显著改变所驱动的，从无杀菌剂控制中的阳性（即35%）到阴性，杀菌剂总浓度为5和50 μg/L（分别为-7%和-32%；图4g)。因此，正如假设的那样，杀菌剂胁迫显然诱导了群落从互补向竞争相互作用的转变。尽管在二元培养基中净多样性效应不受影响，但杀菌剂导致敏感物种和耐受物种之间（图4c和d）以及两种耐受物种之间（图4f）优势的显著改变。
的比例从对照的31%略微降低到26%和19%（图4c）。相反，在杀菌剂浓度为5和50 μg/L时，
的优势度由3%增加至9%和43%（图4d）。在由两个最耐受物种组成的二元培养基中，
的优势维持在杀菌剂总浓度500 μg/L（-32%至-25%；图4f），在环境相关条件下
是最具竞争力的物种。由于在杀菌剂总浓度为2500 μg/L时（31%；图4f），
图4. 总浓度为0、5、50、500和2500 μg/L的杀菌剂的混合培养物对DNA浓度（95%置信区间）的平均多样性影响。净多样性效应（灰色柱状图）由与特质无关的互补性（蓝点）、优势（绿点）和依赖特质的互补性效应（紫色点；有关这些效应的解释，请参阅多样性效应部分）的总和组成叶定植）。黑色和彩色星号分别表示杀菌剂处理和无杀菌剂对照之间的净多样性效应或组分相互作用效应差异显著（Dunnett 检验；
0.05；n = 5）。绘制在阴影区域内的处理包含的物种显然无法在施用的杀菌剂浓度下存活，因为在各自的单一培养处理中没检验测试到麦角甾醇（图1b）。因此，这些处理可能没办法反映真实的相互作用，因此被排除在统计分析之外（AA：
微观研究根据结果得出，AH介导的凋落物分解可能不受环境杀菌剂的影响（图1a）。较低的杀菌剂浓度会对群落组成（图3）和多样性产生显著影响，（数量上）分解过程的维持可能受到高度耐受的物种的保护，例如
（图1），它们共同涵盖了所有研究的参与叶片降解的水解和氧化酶（图2c和d)。然而，这些发现的普遍性要进一步验证，这可能会在未来的实验中使用本研究中应用的工具与更高级别的检测系统（例如，室内或室外河流）观测相结合，涉及不同的AH物种，较高的真菌多样性、不同韧性的叶片基质和波动的测试条件。
与凋落叶分解相似，单独考虑真菌总生物量(即麦角甾醇浓度)作为这一过程的替代变量时，能得出如下结论：AH介导的河流中叶片调节不受环境杀菌剂的影响（图1b）。然而，对消费的人来说，叶片的营养质量取决于真菌群落组成。杀菌剂对四元培养基中群落组成的分析揭示了
（图3a）的显着下降，这是一种河流无脊椎动物优先食用的AH物种。相反，被这些消费者拒绝的AH物种在这个群落中持续存在，即
。此外，这些由杀菌剂引起的AH群落组成的改变反映了早期研究中观察到的变化，证明了上述讨论的无脊椎动物叶片消费者的进食偏好。虽然这种选择性进食背后的机制尚不完全清楚，但一种可能的解释可能是真菌在营养成分等（氨基酸或必需脂肪酸）组成中的种间差异。因此，如果缺乏替代食物来源，化学应激引起的AH群落组成的改变可能会影响消费者的生理健康。
叶片质量损失和真菌总生物量产量是评价基于河流ECO功能完整性的最广泛使用的指标。虽然本研究中应用的压力源（杀菌剂）专对于在这些生态系统中发挥关键功能作用的生物体（真菌），但在环境相关浓度下未曾发现不利的功能影响。然而，高度耐受物种的存在与功能冗余（关于这些变量）相结合，抵消了AH群落组成的改变。尽管之前的研究表明AH群落组成与叶片消费者的生理适合度之间有密切联系，但这种关系的机制基础尚不清楚，要进一步研究。因此，填补这一知识空白可能会促进对潜在压力（杀菌剂）引起的对基于河流食物网的级联效应的评估。
水生丝孢菌（AHs）是一种生活在沉水落叶中的腐生真菌，作为河流ECO中的分解者以及更高营养水平的食物来源发挥着关键的功能作用。杀菌剂控制着病原真菌和靶向真菌中进化保守的分子过程，在农业和城市景观的使用的过程中会污染河流，杀菌剂对水生丝孢菌及其提供的功能将构成了威胁。为了研究杀菌剂对水生丝孢菌群落组成和功能的影响，本研究采用析因微观实验，分别将四种AH单一培养、二元培养和四元培养（11种不同培养基）定植。每个培养物培养于5种浓度的杀菌剂混合物。为了评估这些群落的功能性能，分析了叶片质量损失、真菌生物量产生（通过麦角甾醇）和7种细胞外酶的活性，并通过物种特异性qPCR研究了AH的群落组成。该研究阐明杀菌剂对水生丝孢菌及其提供的功能长期作用机理，为科学评估河流ECO提供相关依据。